體外染色體畸變試驗方法及注意事項

體外染色體畸變試驗的目的是檢測培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體結構畸變。結構畸變可份為染色體型和染色單體型。大多數(shù)化學致突變物誘導染色單體型突變，但染色體型突都也可發(fā)生。多倍體增加表明受試物可導致染色體數(shù)目畸變。但是，本方法不用于檢測數(shù)目畸變。染色體突變和相關事件可以引起很多人類遺傳性疾病，并且有證據(jù)表明，引起體胡魔癌基因和抑癌基因改變的染色體突變以及相關事件，與人類和實驗動物的腫瘤發(fā)生有關。體外柴色體畸變試驗可應用于已建立的細胞系、細胞株或原代細胞培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)生長能力、核型的穩(wěn)定性、染色體數(shù)目、染色體差異以及染色體響變的自發(fā)頻率選擇合適的細胞。

北京匯智泰康醫(yī)藥技術有限公司針對染色體畸變試驗開發(fā)染色體畸變試驗試劑盒， 本試劑盒省去了陽性底物成分準備、誘導 S9 制備，可以直接使用，大大縮短了實驗周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質量檢測，無雜菌污染，誘導 S9 活性均符合染色體畸變試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現(xiàn)性高。染色體畸變試驗試劑盒應用廣泛，可進行食品、化學品、農(nóng)藥、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個方面的遺傳毒理學檢測。

染色體畸變試驗導則

1  規(guī)范性引用文件

OECD. OECD Guidelines for Testing of Chemicals. 473 In vitro Mammalian Test, 1-10. Paris: OECD, Adopted2lst July, 1997.

2  定義

2.1  染色單體型畸變(chromatid-type aberration )

顯示為單個染色單體斷裂或染色體單體間斷裂或斷裂和重接的染色體結構損傷。

2.2  染色體型畸變（chromosome-type aberration）

顯示為兩個染色單體在同一部位斷裂或染色體單體間斷裂或斷裂和重接的染色體結構損傷。

2.3  內(nèi)復制 （endore-duplication）

在DNA復制的S期之后，細胞核未進行有絲分裂就開始了另一個Ｓ期的過程。其結果是染色體有4、8、16…倍的染色單體。

2.4  裂隙（gap）

染色體或染色單體損傷的長度小于一個染色單體的寬度，為染色單體的小錯誤排列。

2.5  有絲分裂指數(shù)（mitotic index）

    處于有絲分裂M期的細胞數(shù)占其總細胞數(shù)的百分數(shù)。細胞增殖程度的指標。

2.6  數(shù)目畸變(numerical aberration)

    染色體數(shù)目改變，不同于所用動物或細胞染色體的正常數(shù)目。

3  原理

體外染色體畸變試驗的目的是檢測培養(yǎng)的哺乳動物細胞染色體結構畸變。結構畸變可份為染色體型和染色單體型。大多數(shù)化學致突變物誘導染色單體型突變，但染色體型突都也可發(fā)生。多倍體增加表明受試物可導致染色體數(shù)目畸變。但是，本方法不用于檢測數(shù)目畸變。染色體突變和相關事件可以引起很多人類遺傳性疾病，并且有證據(jù)表明，引起體胡魔癌基因和抑癌基因改變的染色體突變以及相關事件，與人類和實驗動物的腫瘤發(fā)生有關。體外柴色體畸變試驗可應用于已建立的細胞系、細胞株或原代細胞培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)生長能力、核型的穩(wěn)定性、染色體數(shù)目、染色體差異以及染色體響變的自發(fā)頻率選擇合適的細胞。

4  儀器和設備

   培養(yǎng)箱、恒溫水浴、二氧化碳培養(yǎng)箱、壓力蒸汽消毒器、、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、生物安全柜、離心機、無菌細胞培養(yǎng)瓶，玻璃器皿等。

5  操作方法和程序

5.1  準備

5.1.1  細胞

可利用包括人體細胞在內(nèi)的多種細胞系、細胞株或原代細胞培養(yǎng)，如中國倉鼠成纖維細胞、人或其他哺乳動物的外周血淋巴細胞。

5.1.2  培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

應使用適當?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件(培養(yǎng)皿，CO2濃度，溫度和濕度)維持培養(yǎng)。已確立的細胞系或細胞株應常規(guī)核實染色體眾數(shù)和檢測支原體污染，如有污染則不應使用。應了解正常的細胞周期時間和培養(yǎng)條件。

5.1.3  培養(yǎng)物準備

已建立的細胞系和細胞株:從貯備的培養(yǎng)物中增殖細胞，接種的密度應使細胞在收獲時未達到融合，細胞培養(yǎng)于37C。

淋巴細胞:從健康的個體采得經(jīng)抗凝劑( 如肝素)處理的全血或分離的淋巴細胞，加至含促細胞分裂劑(植物凝集素等)的培養(yǎng)基中，并于37"C培養(yǎng)。

5.1.4  代謝活化

在有或無適當?shù)拇x話化系統(tǒng)條件下，將細胞暴露于受試物。常用的代謝話化系統(tǒng)是以酶誘導劑如Aroclorl254或苯巴比安和β-茶黃酮聯(lián)合處理嚙齒類動物肝臟制備的去線粒體后組分(S9) 及輔因子系統(tǒng)。S9在培養(yǎng)液中終濃度范圍為1%~10% (體積分數(shù))。代謝活化系統(tǒng)的條件可能取決于受試物的類別。在某些情況下，需要使用不同濃度的S9。通過遺傳工程建立的可表達特殊活化酶的細胞系，將使內(nèi)源性活化成為可能。細胞系的選擇要提供科學的依據(jù)(如通過細胞色素P450同工酶與受試物代謝的相關性進行判斷)。

5.2  試驗條件

5.2.1  溶劑/賦形劑

所用溶劑/賦形劑不應與受試物發(fā)生化學反應，并且應對細胞存活率和s9活性無影響。如果采用不常用的溶劑/賦形劑，應有資料表明其對細胞存活率和S9活性無影響。推薦采用水作溶劑賦形劑，當受試物在水中不穩(wěn)定時，則所用的有機溶劑應該是無水的?？墒褂梅肿雍Y去除水。

5.2.2  染毒濃度

在決定高濃度時應考慮受試物的細胞毒性、在試驗系統(tǒng)中的溶解性以及pH或滲透壓的改變。

正式試驗中應該在有和無代謝活化條件下，利用能反映細胞完整性和細胞生長情況的指標來檢測細胞毒性和溶解性，如融合程度、活細胞計數(shù)或有絲分裂指數(shù)等。預試驗有助于確定細胞毒性和溶解性。

至少應設置3個劑量組，在有細胞毒性時，濃度范圍應包括大細胞毒性至幾乎無細胞毒性。組間距為(2~)倍。在收獲時，高濃度組的細胞融合程度、細胞計數(shù)或有絲分裂指數(shù)均應該有顯著降低(大于50%)。有絲分裂指數(shù)只是間接測定細胞毒性/細胞生長抑制作用的方法，而且依賴于細胞處理后的時間，但是，對于懸浮細胞培養(yǎng)物，其他的毒性測試方法可能比較繁瑣且不實用，有絲分裂指數(shù)就比較適用。細胞周期動力學資料如平均傳代時間(average generation time, AGT)可用于作為確定染毒濃度的補充資料。對于相對無細胞毒性的化學物，高濃度應該是5 uL/ml, 5 mg/ml或0.01 mol/L,取低的一種。

無細胞毒性且相對不溶的受試物，所用的高劑量應保證在染毒期末的終培養(yǎng)液中有可見沉淀。在有些情況下(例如僅在略高于低溶解濃度時才出現(xiàn)細胞毒性)，可在多于一個肉眼可見沉淀的濃度進行試驗。應在染毒開始和結束時評價溶解性，因為在試驗系統(tǒng)中存在細胞、S9和血清等，溶解性可能在染毒過程中發(fā)生改變。不溶性之后肉眼可見的沉淀。沉淀不應不干擾計數(shù)結果。

5.2.3  對照

每個試驗應包括在有和無代謝活化條件下同時進行的陽性和陰性(溶劑/賦形劑)對照。在利用代謝活化時，陽性對照應是需要代謝活化才顯示致突變作用的化學物。

陽性對照物(已知的斷裂劑)在暴露水平應有超過本底值的可重復和測量的增加，以證實試驗系統(tǒng)的敏感性。但陽性對照物的濃度不應使讀片者立即發(fā)現(xiàn)其為陽性對照標標本片。陽性對照物如表1所示。

表1  體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗

也可利用其他適當?shù)挠眯詫Ψ?。如有可能，應利用與受試物化學結構相關的陽性對照物。

在每個收獲時間都應包括相應的陰性對照。陰性對照在處理培養(yǎng)液中含溶劑/賦形劑，并以同樣的方法處理培養(yǎng)物。而且，也應該有未染毒對照，除非本底對照資料證明，所選用的溶劑無細胞毒性或致突變作用。

5.3  操作方法

5.3.1  受試物處理

在有和無代謝活化系統(tǒng)條件下，以受試物染毒處于增殖期的細胞。淋巴細胞應在有絲分裂刺激后的48 h開始染毒。

一般對每個濃度和陰性/溶劑對照應該用雙份平行培養(yǎng)物。當本底資料可以證明雙份平行培養(yǎng)物之間變異較小時，對每個濃度改用1個培養(yǎng)物也可以接受。

氣態(tài)或揮發(fā)性物質應以適當?shù)姆椒ㄔ囼灒缬妹荛]的培養(yǎng)瓶。

5.3.2  收獲時間

在一次試驗，細胞應在有和無代活化條件下染毒3~6h,并在染毒開始后約1.5倍的正常細胞周期時采樣。如此方案在有或無代謝活化時均為陰性結果，應再進行一次無代謝活化的試驗，適當延長染毒時間。某些化學物在染毒/采樣時間長于1.5 倍正常細胞周期時更易檢測。在有代謝活化條件下得到陰性結果，需要根據(jù)情況予以證實。如認為陰性結果不必進行證實，應提供適當理由。

5.3.3  染色體制備

在收獲前以秋水仙素或秋水仙胺處理細胞培養(yǎng)物1~3h。各個細胞培養(yǎng)物分別收獲和低滲、固定和染色，以制備染色體。

5.3.4  染色體分析

包括陽性和陰性對照的所有涂片，應在顯微鏡分析之前獨立編號。由于固定過程通常會導致處于分裂中期細胞的同源染色體丟失，因此所計數(shù)細胞的著絲粒數(shù)應等于細胞染色體眾數(shù)+2。每個濃度組和對照組至少計數(shù)200個分散良好的中期相細胞(如果可行，2個平行培養(yǎng)樣分別計數(shù)100個細胞)。當觀察的畸變數(shù)很高，計數(shù)的中期相數(shù)可以減少。

雖然此試驗的目的是檢測染色體結構畸變，但應同時觀察和記錄多倍體和內(nèi)復制。

6  大鼠肝微粒體酶的誘導和S₉的制備

6.1  誘導

泛應用的大鼠肝微粒體酶的誘導劑是多氯聯(lián)苯（PCB混合物），選擇健康雄性大鼠體重200g左右，一次腹腔注射誘導劑，劑量為500mg/kg體重。誘導劑溶于玉米油中，濃度為200mg/mL。本巴比鈉和β-萘黃酮結合也可做為誘導劑。

1.  S₉制備

動物誘導后第五日斷頭處死。處死前12h停止飲食，但可自由飲水。首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化家溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化加溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化家溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S₉）分裝于塑料管中。每管裝2 mL ~3 mL。儲存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝S₉所用一切手術器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S₉制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進行鑒定。大鼠肝微粒體肝S9制備過程時間較久，也可以直接聯(lián)系北京匯智泰康購買現(xiàn)有肝微粒體，肝S9，NADPH再生系統(tǒng)，UGT孵育系統(tǒng)等產(chǎn)品。

高7  數(shù)據(jù)和報告

7.1  數(shù)據(jù)處理

試驗單位是細胞，應評價有染色體結構畸變細胞百分率。對染毒組和對照組應列出染色體結構畸變的類型及其數(shù)目和頻率。應分別記錄裂除并報告，但一般不包括在總畸變率中。

應記錄同時進行的所有染毒組和陰性對照組細胞毒性結果。

應提供各個培養(yǎng)物的資料，并且以表格形式總結所有的資料。

對明確的陽性結果不要求證實。對可疑的結果應進一步試驗， 改變試驗條件。應對陰性結果進行證實，方法如5.3.2 所述。在進一步試驗中應考慮改變試驗參數(shù)，包括改變濃度間距和代謝活化條件。

7.2  結果、評價和解釋

判斷陽性結果的標準為染色體畸變細胞數(shù)有濃度相關性增加和/或在一個或多個濃度有可重復的增加。應首先考慮結果的生物學意義。利用統(tǒng)計學方法分析，以有助于評價試驗結果。但是，統(tǒng)計學顯著性不應是確定陽性反應的-因素。

多倍體的細胞數(shù)增加可表明受試物能抑制有絲分裂過程和導致染色體數(shù)目畸變，內(nèi)復制的細胞數(shù)增加可表明受試物抑制細胞周期進展。

結果不符合上述標準的受試物，可認為在本系統(tǒng)為陰性結果。

雖然大多數(shù)試驗將得到明確的陽性或陰性結果，但在極少情況下，所得到的資料不能對受試物的致突變性進行明確的判斷。經(jīng)多次重復試驗，結果仍然是可疑的。

體外染色體略變試驗的陽性結果表明受試物能對培養(yǎng)的哺乳動物體細胞誘導染色體畸變。陰性結果表明在試驗條件下受試物對培養(yǎng)的哺乳動物體細胞不能誘發(fā)染色體畸變。晴變。

1. 試驗的解釋和評價

8.1  體外試驗一般需要外源性代謝活化系統(tǒng)的支持。此代謝活化系統(tǒng)不可能*模擬哺乳動物體內(nèi)條件。應注意避免假陽性結果的發(fā)生，這些假陽性結果可能由于pH、培養(yǎng)基滲透壓的改變或高度細胞毒性所致。

8.2  本試驗用于篩選可能的哺乳動物致突變物和致癌物。本試驗結果為陽性的很多化學物是哺乳動物致癌物；但本試驗和致癌性之間并無很好的相關性。相關性取決于化學物類別，已有證據(jù)表明此試驗未檢出的致癌物并不是通過直接損傷DNA的機制起作用的。

體外染色體畸變試驗試劑盒優(yōu)勢
便捷—— 本試劑盒省去了誘導 S9 制備，陽性底物、秋水仙素的配制和濃度條件摸索的時間，可以直接使用，大大縮短了實驗周期。 準確——本試劑盒各成分均經(jīng)過嚴格的質量檢測，無雜菌污染，誘導 S9 活性均符合體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗要求，實驗結果準確、可靠、重現(xiàn)性高。
穩(wěn)定—— 本試劑盒穩(wěn)定性強、易于運輸和保存。
試劑盒使用操作流程
1. 實驗器材、試劑準備：1640RPMI培養(yǎng)基、牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶消化液、75，25cm²細胞培養(yǎng)瓶、,50mL 或 15mL 試管、200μl 和1000μl 槍頭、0.22μm 濾膜、注射器、平皿、二甲基亞砜、滅菌 蒸餾水等；
2. 設置待測物劑量，配制各劑量無菌待測物溶液；
3. 將處于對數(shù)生長期，貼壁生長良好的CHL細胞用0.25 %胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化處理制成細胞懸液，5 mL/瓶接種于25cm²細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中加濕培養(yǎng)約24 h-48h；
4. 吸去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試物、0.05mL S9混合液（不加S9混合液時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液補足至5mL，于培養(yǎng)箱中處理6h，換成含有10%牛血清的*培養(yǎng)基。在收獲細胞前4 h加入細胞分裂中期阻斷劑秋水仙素溶液（終濃度為0.2 mg/mL）；
5. 用0.25%的胰蛋白酶溶液消化細胞，加入0.075mol/L氯化加溶液進行低滲處理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）進行固定并滴片，用吉姆薩染液染色，中性樹膠封片，并于油鏡下進行閱片，記錄畸變細胞的坐標位置及畸變類型，具體操作方法參照國標方法進行；
6. 閱片。

試驗設計及受試物的特殊處理
1) 劑量設計 決定受試物高劑量的原則是受試物對試驗細胞的毒性和受試物的溶解度。對于純的化學物質，一般高劑量為 5 mg，或溶解度允許，或飽和濃度，或對細胞產(chǎn)生小毒性濃度。對于毒性很低、攝入量很大的定型產(chǎn)品，可根據(jù)其溶解度和對細菌的毒性采用可能的大劑量，至少3個劑量組，每個劑量應做2個平皿。
2) 溶劑 溶劑可選用水、二甲基亞砜或其他溶劑（溶劑劑量應限定在毒性劑量以下。以二甲基亞砜為例，一般不超過1%）， 無論選用什么溶劑均應無誘變性。
3) 對照組的設置 試驗應同時設有陽性物對照組、溶劑對照組和未處理對照，均包括加S9和不加S9兩種情況。
4) 受試物的特殊處理 若遇特殊受試物作非常規(guī)處理時應在報告中說明。對以下幾種情況可作如下處理：
a)  食品包裝材料及其制品成分：根據(jù)材料或制品的組成成分，可分別采取過篩抽提、蒸發(fā)殘渣等技術處理。
b)  揮發(fā)性受試物：可采用真空干燥器處理等方法。
c)  天然植物材料：可按植物化學方法制備粗制品或純制品。

常見問題及原因分析
1、收獲細胞較少：貼壁細胞生長到70-80%左右時開始染毒，人或哺乳動物外周血淋巴細胞；
2、自發(fā)回變數(shù)顯著高于標準 原因：a. 培養(yǎng)基配制操作過程中組氨酸、生物素添加量高；b.培養(yǎng)皿經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒不*或環(huán)氧乙烷有殘留；
3、陽性底物誘變菌落數(shù)偏離標準范圍 原因：a. 陽性底物溶解不*或未充分混勻；b. 陽性底物添加量不準確；c. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9失活；d. 操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
4、待測物誘變菌落數(shù)非常低或沒有菌落 原因：a. 待測物或待測物溶劑對細菌生長有毒性；b. 試劑盒保存條件不合適或過期，陽性底物降解或 S9 失活； c. 操作過程中添加菌液時頂層培養(yǎng)基溫度過高；
5、菌落分布不均勻，集中偏向一側。原因： 倒底層或頂層培養(yǎng)基時平皿未水平放置；
6、頂層或底層培養(yǎng)基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 頂層或底層培養(yǎng)基中瓊脂粉含量低；b. 頂層培養(yǎng)基中加入的溶劑或待測物酸化，導致凝膠不充分；
7、如何判斷 Ames 實驗結果是否為假陽性 將經(jīng)受試物和陽性對照物處理的 Ames 菌落進行增菌培養(yǎng)后接種于無組氨酸的培養(yǎng)基上,觀察比較細菌的生長情況。如果經(jīng)受試 物處理的菌株不能生長在無組氨酸的培養(yǎng)基中,而經(jīng)陽性對照物處 理的菌株則可以生長在無組氨酸的培養(yǎng)基上,則說明經(jīng)受試物處理 的菌株沒有發(fā)生突變，試驗中所觀察到的菌落數(shù)增加是假陽性。